Dag 3 samt 4

Dag 4

1. Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

Vid båda fallen erhålls ett resultat som visar om LL 37 genen finns, det som är positivt med PCR är att det är snabbt utfört och är en simpel procedur. Problemet med PCR är dock risken för kontamination av provet och ett falskt positivt resultat, detta testas dock med positiv och negativ kontroll, dessa kontroller finns dock ej med i figur 1.

Figur 1. Visar resultat av PCR(tjockt band t.v.) vid gelelektrofores. Detta var en kontrollelektrofores för klyvda plasmider för att verifiera att klyvning av plasmid uppstått och LL37 genen finns(band 4 fr. v.).

Vid southern blotting så utförs hela proceduren i flera steg och vissa tar väldigt lång tid, ex. inkubering för hybridisering över natten. Southern är dock säkrare vid resultat mätning om allt utförts rätt, för proben som används ska vara komplementär med den sekvens man vill mäta, genom stringens tvätt så slipper man ospecifika bindningar till andra än målsekvensen. Resultatet i southern består av en reaktion med antikroppar som ger en färg reaktion vid tillsats av ämne, vid denna laboration användes Anti-digoxigenin-Alkaline Phosphatase antibody, som är en antikropp med alkaliskt fosfatas enzym som binder till digoxigenin som var inbundet till proben. Tillsats av NBT och BCIP gav en reaktion hos enzymet som utgav färg, reaktionen utfördes i mörker.

Figur 2. Visar resultat från southern blotting med färgning av prober som bundit till LL37 gener, bilden är spegelvänd figur 1, dvs. PCR är längst till höger. 

2. Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?  

Det viktigaste är att få laborationen att flyta på och kunna utföra flera metoder. Har även lärt mig hur southern blot fungerar samt skillnaderna mellan denna och PCR och fördelarna av dessa.

Laboration Dag 2

Dag 2

Att fundera över:

Idag har du utfört en PCR.

Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

PCR utfördes men resultat uteblev vid UV-strålning. När loadingbuffer tillsattes i proverna som laddades i brunnarna i gelen så blev proverna blå då det binder till DNA:t. Gel samt TAE buffert vid elektrofores skulle ha pH 8 samt koncentrationen 1x, en 50x TAE buffert användes och späddes med destillerat vatten. Den koncentrerade TAE bufferten hade dock ungefär pH 4, vilket ledde till att vid laddning av brunnar och utförande av elektrofores så förlorade DNA en del av den negativa laddningen och loadingbuffer kunde inte binda. Detta resulterade i att DNA ej erhöll någon färg vid mätningen med UV och man kunde se att de laddade proverna som vandrade i gelen blev gula efter en längre tid i bufferten.

Lösningen för 50x TAE bufferten utfördes av andra laboranter och möjligt fel i detta fall är missförstånd  av instruktionerna för lösningsberedning. Annat möjligt fel för detta är fel inställd pH-meter eller utebliven pH mätning. 

Figur 1: Visar det vandrade DNA:t som förlorat loadingbuffer färgningen och blivit gult.

Vid mätning med UV av förlorad loadingbuffer så erhölls endast en svart bild eller möjligtvis en svag infärgning om elektrofores avbröts i tid.

För att få resultat av laborationen och veta om provet innehåller RNA eller större Kromosomalt DNA så utförs elektrofores vid nästa laborationstillfälle samtidigt som southern blot utförs, på detta sätt uteblir ingen information om preparatet med LL37 genen.

Laboration Dag 1

Dag 1 - frågor

Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.

Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Vi renade plasmid från celldebris, RNA, proteiner samt kromosomalt DNA genom att lysera cellen med SDS och NaOH. Kromosomalt DNA har en super coil formation och DNA:t denatureras av NaOH. När man sedan naturaliserade lösningen så klumpar sig DNA när det återbildar vätebindningar. Sedan centrifugerades preparatet och rent plasmid skulle erhållas i supernatanten. Detta testades genom att mäta absorbansen i spektrofotometern på absorbansen 260 som var absorbansen för DNA samt 280 som var absorbansen för protein.

Kvoten beräknades genom att dela absorbansen vid 260 delat med absorbansen vid 280. Rent DNA hade kvoten 1,8 men ett bra preparat kunde ha kvoten mellan 1,6-2,0. 1,8 kunde ändå vara ett falskt positiv för rent preparat då det är möjligt att andra ämnen höjde både absorbansen vid 260 och 280 vilket leder till att preparatet ej är rent. För att säkerställa renhet utförs PCR samt elektrofores på dag 2 vilket visar mängd förorening i preparatet.