Dag 1 - frågor
Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.
Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?
Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?
Vi renade plasmid från celldebris, RNA, proteiner samt kromosomalt DNA genom att lysera cellen med SDS och NaOH. Kromosomalt DNA har en super coil formation och DNA:t denatureras av NaOH. När man sedan naturaliserade lösningen så klumpar sig DNA när det återbildar vätebindningar. Sedan centrifugerades preparatet och rent plasmid skulle erhållas i supernatanten. Detta testades genom att mäta absorbansen i spektrofotometern på absorbansen 260 som var absorbansen för DNA samt 280 som var absorbansen för protein.
Kvoten beräknades genom att dela absorbansen vid 260 delat med absorbansen vid 280. Rent DNA hade kvoten 1,8 men ett bra preparat kunde ha kvoten mellan 1,6-2,0. 1,8 kunde ändå vara ett falskt positiv för rent preparat då det är möjligt att andra ämnen höjde både absorbansen vid 260 och 280 vilket leder till att preparatet ej är rent. För att säkerställa renhet utförs PCR samt elektrofores på dag 2 vilket visar mängd förorening i preparatet.
Inga kommentarer:
Skicka en kommentar