Dag 2
Att fundera över:
Idag har du utfört en PCR.
Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?
Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?
Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?
PCR utfördes men resultat uteblev vid UV-strålning. När loadingbuffer tillsattes i proverna som laddades i brunnarna i gelen så blev proverna blå då det binder till DNA:t. Gel samt TAE buffert vid elektrofores skulle ha pH 8 samt koncentrationen 1x, en 50x TAE buffert användes och späddes med destillerat vatten. Den koncentrerade TAE bufferten hade dock ungefär pH 4, vilket ledde till att vid laddning av brunnar och utförande av elektrofores så förlorade DNA en del av den negativa laddningen och loadingbuffer kunde inte binda. Detta resulterade i att DNA ej erhöll någon färg vid mätningen med UV och man kunde se att de laddade proverna som vandrade i gelen blev gula efter en längre tid i bufferten.
Lösningen för 50x TAE bufferten utfördes av andra laboranter och möjligt fel i detta fall är missförstånd av instruktionerna för lösningsberedning. Annat möjligt fel för detta är fel inställd pH-meter eller utebliven pH mätning.
Figur 1: Visar det vandrade DNA:t som förlorat loadingbuffer färgningen och blivit gult.
Vid mätning med UV av förlorad loadingbuffer så erhölls endast en svart bild eller möjligtvis en svag infärgning om elektrofores avbröts i tid.
För att få resultat av laborationen och veta om provet innehåller RNA eller större Kromosomalt DNA så utförs elektrofores vid nästa laborationstillfälle samtidigt som southern blot utförs, på detta sätt uteblir ingen information om preparatet med LL37 genen.
Hej Anders!
SvaraRaderaTycker att du har angett en riktig bra och detaljerad orsak till varför resultatet hade blivit så. Dina förklaringar är så tydliga och lätt att hänga med. Måste bara säga att ni hade en super fin gel med mycket synliga brunnar! Lycka till med nästa laborationstillfälle!
Dieu Linh
Hej! Det är ju spännande att se när det blir fel också och spekulera i vad det kan bero på, även om det såklart hade varit smidigare för er att kunna se UV-resultatet. Detta visar ju inte minst hur viktigt det är att kunna bereda lösningar! Vad de som gjorde bufferten har gjort vet vi ju inte, men jag tycker du kommer med bra tänkbara orsaker.
SvaraRadera/Annika
Tråkigt att ni inte kunde se något på elektroforesen, men du har som sagt en bra förklaring till det. Det är viktigt att kunna tolka resultatet av en elektrofores så kolla att du vet vad man får ut av en sån kontroll på nästa elektrofores (du är lite otydlig när du skriver "en mängd föroreningar").
SvaraRaderaAnnica
Med "mängd förorening"(från dag 1) menar jag att det som ej ska förekomma i provet efter rening visas vid elektroforesen, dvs RNA eller kromosomalt DNA. Vid spektrofotometrin kunde vi konstatera att vårat preparat var någorlunda rent från protein eftersom vi hade kvoten 1,8. Detta kan vara ett falskt värde om det finns annat som höjer absorbansen vid 260, tex. kromosomalt DNA, därför utförs kontrollelektroforesen!
RaderaMvh Anders J.